HAEMOGLOBINOPATHY – Sàng lọc và chẩn đoán

NTTU – HAEMOGLOBINOPATHY là bệnh di truyền thường gặp nhất trên thế giới, chiếm khoảng 7% dân số thế giới mang gen bệnh dị hợp tử và khoảng 300.000 – 500.000 trẻ em/năm sinh ra mắc bệnh hemoglobinopathy thể nặng với khả năng tử vong cao

Đối với các dân tộc khác nhau ở Việt Nam, tỉ lệ dân số mang gen bệnh đạt 1,5–25%, làm cho emoglobinopathy trở thành một vấn đề sức khỏe đáng quan tâm, không chỉ ở quy mô bệnh lâm sàng mà cả ở quy mô cộng đồng.

Hemoglobin là một dạng Protein của tế bào hồng cầu, giúp vận chuyển oxy trong máu, tuần hoàn từ phổi đến các mô và cơ quan trong cơ thể. Nếu xuất hiện bất thường, có thể gây thiếu oxy cho mô và cơ quan.

Hemoglobinopathy là một nhóm bệnh lý rất đa dạng về mặt sinh lý bệnh học cũng như triệu chứng lâm sàng, được chia thành 2 nhóm:

   – Nhóm bệnh lý liên quan đến sự hiện diện bất thường về cấu trúc của hemoglobin, có hoặc không có triệu chứng lâm sàng.

   – Nhóm bệnh lý liên quan đến mức độ tổng hợp chuỗi globin như giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin.

Đối với các cá nhân đang có dự định kết hôn nhưng nghi ngờ mắc một số bệnh Hemoglobinopathy, cần tiến hành xét nghiệm tầm soát khả năng di truyền cho thế hệ sau và đề xuất các liệu pháp điều trị thích hợp khi mang thai. Các trường hợp ngộ độc chì, thiếu máu không rõ nguyên nhân, thiếu máu hồng cầu nhỏ không giảm sắc, các bệnh mãn tính, bất thường về hồng cầu, tiền sử gia đình mắc bệnh hoặc kết quả sàng lọc trước sinh/test sàng học dương tính. Điện di Hemoglobin là xét nghiệm thường quy sử dụng trong sàng lọc và chẩn đoán trường hợp nghi ngờ mắc Hemoglobinopathy. Xét nghiệm thực hiện dựa trên nguyên tắc là các phân tử tích điện hòa tan hay phân tán trong chất điện giải sẽ di chuyển khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển về phía cực âm, anion di chuyển về phía cực dương, các phân tử không mang điện tích sẽ không di chuyển. Như vậy, sau khi điện di, các thành phần Hemoglobin khác nhau trong mẫu máu sẽ được tách ra, từ đó có thể định danh và xác định nồng độ.

Xét nghiệm điện di mao quản: Cấu trúc không gian của Hemoglobin phụ thuộc vào bản chất và trình tự của chuỗi acid amin. Do đó, khi có sự thay đổi về thành phần acid amin do đột biến thì sẽ tạo ra những biến thể Hemoglobin có những khác biệt về điện tích bề mặt. Vì vậy, các loại Hemoglobin khác nhau sẽ được nhận diện bằng điện di trong các dung dịch đệm đặc trưng. Dựa vào hệ thống tự động, phân tách nhanh chóng và chính xác các thành phần Hemoglobin với ưu điểm nhạy, xác định chính xác các thành phần có nồng độ thấp như HbA2 và HbF, các biến thể đột biến phục vụ cho quá trình phân tích tình trạng dịch tễ.

Xét nghiệm điện di sắc ký lỏng áp suất cao dựa trên hệ thống bơm đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao thông qua pha tĩnh và pha động. Mỗi thành phần trong mẫu tương tác khác nhau với vật liệu hấp phụ nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau dẫn tới sự phân tách riêng biệt các thành phần.

Xét nghiệm Gene – chip ứng dụng trong nhận diện gen, biểu hiện gen, lập bản đồ gen và phát hiện đột biến. Các chip thường bao gồm một tập hợp các vi điểm được sắp xếp trên bề mặt, trong đó mỗi vi điểm chứa một trình tự axit nucleic là các đầu dò có bản chất là DNA hoặc cDNA được khuếch đại bằng xét nghiệm PCR hoặc các oligonucleotide đặc hiệu cho alen quy định các kiểu hình tương ứng để nhận diện các đột biến trên các đoạn DNA mạch đơn trên đối tượng nghi ngờ mắc bệnh Hemoglobinopathy.

Xét nghiệm Microarray: ứng dụng phân tích các đột biến điểm của globin liên quan đến rối loạn tổng hợp huyết sắc tố thông qua các đầu dò oligonucleotide đặc trưng cho alen. Các đầu dò được thiết kế nhận diện các đột biến và tính đa hình của đoạn gen mục tiêu đã được cố định ở đầu 5′  và đầu 3′ được kích hoạt phản ứng thông qua các enzym. Quá trình PCR được diễn ra nhằm khuếch đại DNA chứa các vùng đột biến hoặc SNP trên các vị trí microarray chip cố định thông qua phản ứng với dideoxynucleotide đã được đánh dấu và bắt cặp bổ sung với DNA mục tiêu cho đến khi phản ứng kết thúc. Kết quả được phân tích thông qua các bước sóng nhận diện các tín hiệu huỳnh quang khác nhau từ các thuốc nhuộm Fluorescein, Cy3, Cy5 và Texas Red) đã được tích hợp tại mỗi vị trí chứa đoạn dò oligonucleotide trên microarray. Xét nghiệm Arrayed Primer Extension – APEX đã được cải tiến nhằm phát hiện đột biến β-globin và xác định tính đa hình của các biến thể thông qua ThalassoChip  – công cụ chẩn đoán di truyền β-thalassemia phát hiện hơn 60 đột biến và tính đa hình gen β-globin chỉ trong một bước thực hiện. Nhược điểm lớn của microarray trong việc phát hiện đột biến điểm so với giải trình tự DNA là chip microarray chỉ phát hiện những thay đổi nucleotide tương ứng với các đầu dò đã được thiết kế. Các dạng đa hình và các đột biến mới sẽ không thể nhận diện hoặc cho kết quả sai lệch. Đặc biệt, Microarray có yêu cầu khá cao về mặt kỹ thuật đối với thao tác xử lý mẫu và phân tích dữ liệu, do đó đòi hỏi người vận hành được đào tạo chuyên sâu.

K. Kỹ thuật xét nghiệm y học

Tài liệu tham khảo

1.   EMERGING TECHNOLOGIES FOR HAEMOGLOBINOPATHY SCREENING AND DIAGNOSIS, Prevention of Thalassaemias and Other Haemoglobin Disorders: Volume 2: Laboratory Protocols [Internet]. 2nd edition, chapter 7.

2.   Roger Bumgarner, DNA microarrays: Types, Applications and their future. Curr Protoc Mol Biol. 2013 Jan;0 22:Unit–22.1..

3.   Joseph Hacia et al, 1998. Applications of DNA Chips for Genomic Analysis. Molecular Psychiatry 3(6):483-9.